ประสิทธิภาพในการยับยั้งเชื้อ Escherichia coli และ เชื้อ Staphylococcus aureus ของสารสกัดจากรากบัว และเปลือกหุ้มผลของบัวหลวงบุณฑริก

ประสิทธิภาพในการยับยั้งเชื้อ Escherichia coli และ เชื้อ Staphylococcus aureus ของสารสกัดจากรากบัว    และเปลือกหุ้มผลของบัวหลวงบุณฑริก

Inhibitory Effect on Escherichia coli and Staphylococcus aureus of Crude extract of Seed Coat Lotus and Lotus root ( Nelumbo nucifera Gaertn.)

กนกวรรณ คุณาคุณ กันต์ฤทัย  คุณเลี้ยง ชนกสุดา อมรรัตนดิลก

จริยา  จันทวี  เครือวัลย์  ตุ้มสังข์ทอง

โรงเรียนนารีนุกูล อำเภอเมือง จังหวัดอุบลราชธานี

บทคัดย่อ

               การศึกษาคุณสมบัติของรากบัว  และเปลือกหุ้มเมล็ดของบัวพบว่ามีสารชนิดต่างๆ ในส่วนประกอบของบัวหลวง ที่มีสรรพคุณในการบำรุงร่างกายหรือนำมาปรุงเป็นยารักษาโรคได้ ในสมัยก่อนคนไทยนิยมนำรากบัวมาต้มแก้อาการผิดปกติในระบบทางเดินอาหาร (เดลินิวส์) เปลือกผลบัวมีฤทธิ์แก้อาการท้องเดิน ซึ่งทั้งรากบัวและเปลือกหุ้มผลบัวมีสารแทนนินเป็นสารที่มีรถฝาดสมานมีฤทธิ์ช่วยยับยั้งอาการท้องเดิน และมีฤทธิ์ในการยับยั้งเชื้อแบคทีเรียต่างๆได้ (ปิยะวดี เจริญวัฒนะ, สุมนา ปานสมุทร, ดำรงค์ คงสวัสดิ์ และอำนวย เพชรประไพ) ดังนั้นงานวิจัยนี้จึงได้ศึกษาการยั้งยั้งเชื้อแบคทีเรีย  Escherichia coli และ Staphylococcus aureus ที่เป็นสาเหตุของโรคในระบบทางเดินอาหาร โดยใช้สารสกัดจากเปลือกหุ้มผลและรากบัวสกัดโดยการปั่นและคั้นเอาน้ำสารสกัดที่กรองด้วยกระดาษกรองและที่กรองไวรัสเรียบร้อยแล้วนำสารสกัดแต่ชนิดมาทดสอบการยับยั้งเชื้อแบคทีเรีย Escherichia coli และ เชื้อ Staphylococcus aureus  เลี้ยงด้วยวิธี agar diffusion พบว่าสารสกัดจากเปลือกผลบัวไม่สามารถยับยั้งเชื้อ Escherichia coli และ เชื้อ Staphylococcus aureus  ได้ สารสกัดจากรากบัวสามารถยับยั้งเชื้อ Escherichia coli แต่ไม่สามารถยับยั้งเชื้อ Staphylococcus aureus  ได้ 

 

คำสำคัญ สารสกัดจากเปลือกผลบัว  สารสกัดจากรากบัว เชื้อ Escherichia coli  เชื้อ Staphylococcus aureus  

1.บทนำ

บัวเป็นพืชชนิดหนึ่งที่อยู่คู่คนไทยมาช้านาน บัวไม่ได้เป็นเพียงพืชธรรมดาที่ให้ประโยชน์ได้เฉพาะการนำไปใช้ไหว้พระ นำไปรับประทาน หรือนำไปปลูกไว้เพื่อประดับให้สวยงามเท่านั้น บัวยังสามารถใช้เป็นพืชสมุนไพรในการรักษาโรคได้ จากการศึกษาวิจัยพบสารชนิดต่างๆ ในส่วนประกอบของบัวหลวง ที่มีสรรพคุณในการบำรุง ร่างกายหรือนำมาปรุงเป็นยารักษาโรคได้ รากบัว  และเปลือกหุ้มผล พบสารพวกแทนนิน (Tannin) เป็นสารฝาดสมานที่มีฤทธิ์ช่วยยับยั้งอาการท้องเดิน หรือโรคที่เกิดในระบบทางเดินอาหาร คณะผู้จัดทำจึงสนใจที่จะทดสอบการยับยั้งเชื้อ Escherichia coli และ เชื้อ Staphylococcus aureus   ซึ่งเป็นเชื้อแบคทีเรียที่ก่อให้เกิดโรคในระบบทางเดินอาหาร ด้วยสารสกัดจากเปลือกหุ้มผลและรากบัว

2.วัสดุอุปกรณ์และวิธีการ

1. สกัดสารจากเปลือกหุ้มผลและรากของบัวหลวง โดยล้างให้สะอาดแล้วนำมาหั่นให้เป็นชิ้นเล็กๆ ปั่นให้ละเอียดและนำมาใส่ในผ้าขาวบางเพื่อที่จะคั้นเอาน้ำสารสกัดพอได้น้ำสารสกัดจากเปลือกหุ้มผลและรากบัว ก็นำไปกรองอีกครั้ง โดยกรองผ่านกระดาษกรองเบอร์ 1 แล้วใส่ในถุงร้อนนำสารสกัดในถุงร้อนมากรองด้วยที่กรองแบคทีเรียและไวรัสเพื่อกรองเชื้ออีกครั้งนำมาใส่ในถุงร้อนถุงใหม่ได้สารสกัดจากเปลือกหุ้มผลและรากบัว

2. นำสารสกัดหยาบมาศึกษาฤทธิ์ในการยับยั้งเชื้อแบคทีเรีย Escherichia coli และ เชื้อ Staphylococcus ด้วยวิธี agar diffusion ตามวิธีของ Kostecki และคณะ (2004) โดยนำเชื้อแบคทีเรียก่อโรคดังกล่าวมาเลี้ยงในอาหารเหลว Luria bertani broth, miller; LB บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 24 ชั่วโมง แล้วนำเชื้อแบคทีเรียที่บ่มไว้มา streak ลงใน plates  เลี้ยงบนอาหาร LB (ศรัญญา พรศักดา, มาระตรี เปลี่ยนศิริชัย, กิตติ ศรีสะอาด, มัณฑนา นครเรียบ ,ประชุมพร เลาห์ประเสริฐ, ทวีรัตน์ วิจิตรสุนทรกุล  และทรงศิลป์.พจน์ชนะชัย) นำแผ่น disc วางไว้ในจานเพาะเลี้ยงเชื้อ 2 แผ่น โดยดูดน้ำกลั่น 50 µL. แล้วหยดลงบน disc แผ่นที่ 1 เป็นตัวควบคุมและดูดสารสกัดจากรากบัวที่สกัดได้ในปริมาณ 50 µL. แล้วหยดลงบน disc แผ่นที่ 2 เป็นตัวทดลอง เปลือกหุ้มผลบัวก็ทำเช่นเดียวกัน (ทำ 3 ซ้ำ)บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 24 ชั่วโมง เก็บข้อมูลโดยวัดเส้นผ่านศูนย์กลางบริเวณใส (clear zone) ด้วยไม่บรรทัดจากวงใสขอบซ้ายถึงขวา บันทึกผลการทดลอง

3. ผลการทดลอง

จากการทดลองพบว่าสารสกัดจากเปลือกหุ้มผลของบัวหลวงบุณฑริกไม่สามารถยับยั้งเชื้อ Escherichia coli และ เชื้อ Staphylococcus aureus ได้

เชื้อ  เพลต	1	2	3
Escherichia coli	-	-	-
Staphylococcus aureus	-	-	-

ตาราง 1.ผลการยับยั้งเชื้อของสารสกัดจากเปลือกหุ้มผลของบัวหลวงบุณฑริก

*หมายเหตุ* เครื่องหมาย – คือ สารสกัดจากเปลือกหุ้มผลของบัวหลวงบุณฑริกไม่สามารถยับยั้งเชื้อได้

จากการทดลองพบว่าสารสกัดจากรากบัวของบัวหลวงบุณฑริกสามารถยับยั้งเชื้อ Escherichia coli แต่ไม่สามารถยับยั้ง เชื้อ Staphylococcus aureus ได้

เชื้อ  เพลต	1	2	3
Escherichia coli	0.8  cm	1.0  cm	1.0  cm
Staphylococcus aureus	-	-	-

ตาราง 2.ผลการยับยั้งเชื้อของสารสกัดจากรากของบัวหลวงบุณฑริก

*หมายเหตุ* เครื่องหมาย – คือ สารสกัดจากรากบัวของบัวหลวงบุณฑริกไม่สามารถยับยั้งเชื้อ Staphylococcus aureus ได้ และ ตัวเลขในตาราง คือ เส้นผ่านศูนย์กลางของ clear zone

สรุปการยับยั้งเชื้อของสารสกัดทั้งสองชนิด

เชื้อ	สารสกัด
	สารสกัดจากเปลือกหุ้มผล			สารสกัดจากรากบัว
	เพลตที่ 1	เพลตที่ 2	เพลตที่ 3	เพลตที่ 1	เพลตที่ 2	เพลตที่ 3
Escherichia coli	-	-	-	0.8 cm	1.0 cm	1.0 cm
Staphylococcus aureus	-	-	-	-	-	-

ตาราง 3 สรุปการยับยั้งเชื้อทั้งสองชนิด

*หมายเหตุ* เครื่องหมาย – คือ สารสกัดจากเปลือกหุ้มผลและรากบัวของบัวหลวงบุณฑริกไม่สามารถยับยั้งเชื้อได้ และ ตัวเลขในตาราง คือ เส้นผ่านศูนย์กลางของ clear zone

4. สรุปและอภิปรายผล

          การศึกษาฤทธิ์ในการยับยั้งเชื้อ Escherichia coli และเชื้อ Staphylococcus aureus ของสารสกัดหยาบจากเปลือกหุ้มผลบัว และรากบัว  พบว่าสารสกัดจากเปลือกหุ้มผลบัวไม่สามารถยับยั้งเชื้อได้ทั้งสองชนิด ซึ่งอาจเป็นเพราะมีสารในการยับยั้งไม่เพียงพอต่อการยับยั้งเชื้อ ส่วนสารสกัดจากรากบัวสามารถยับยั้งเชื้อ Escherichia coli ได้ แต่ไม่สามารถยับยั้งเชื้อ Staphylococcus aureus จากการทดสอบฤทธิ์ในการยับยั้งเชื้อ Escherichia coli  ที่ความเข้มข้น 100 เปอร์เซ็นต์ ทำให้มีเส้นผ่านศูนย์กลางของโซนใส 0.8 , 1.0 และ 1.0 เซนติเมตร ตามลำดับ อย่างไรก็ตามแม้ว่าสารสกัดหยาบจากรากบัวมีประสิทธิภาพในการยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อแบคทีเรีย Escherichia coli ได้ แต่ความสามารถในการยับยั้งเชื้อแบคทีเรีย โดยดูจากขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางของโซนใส ยังมีขนาดเล็ก ซึ่งน่าจะเกิดจากสารบางชนิดในรากบัวที่มีฤทธิ์ในการยับยั้งการเจริญของแบคทีเรียในปริมาณน้อย และขึ้นอยู่กับชนิดของแบคทีเรีย  จึงทำให้โซนใสมีขนาดเล็ก ซึ่งขณะนี้ผู้วิจัยกำลังดำเนินการทดลองเพิ่มเติมเกี่ยวกับการสกัดด้วยตัวทำละลาย หรือศึกษาตัวทำละลายให้เหมาะสมกับสารที่เราต้องการสกัด เพื่อจะได้สารที่ต้องการให้ออกมามากที่สุด และศึกษาชนิดของรากบัวให้มากขึ้น เพื่อเป็นแนวทางในการเลือกสารสกัดที่มีประสิทธิภาพมากที่สุดในการยับยั้งการเจริญเติบของเชื้อแบคทีเรียที่ก่อโรคในระบบทางเดินอาหาร

5. ข้อเสนอแนะ

          ควรศึกษาวิธีการสกัดสารที่สามารถสกัดแล้วสามารถยับยั้งเชื้อได้ดี มีโซนใสบริเวณกว้าง ประหยัดค่าใช้จ่ายและงบประมาณ

กิตติกรรมประกาศ

          ผลการทดสอบประสิทธิภาพในการยับยั้งเชื้อ Escherichia coli และ เชื้อ Staphylococcus aureus ของสารสกัดจากรากบัว    ดีบัว และเปลือกหุ้มเมล็ดของบัวหลวงบุณฑริกจะสำเร็จลุล่วงไปไม่ได้ถ้าขาดบุคคลดังนี้ คือ คุณครูจริยา จันทวี คุณครูเครือวัลย์ ตุ้มสังข์ทอง ครูที่ปรึกษาโครงงาน มหาวิทยาลัยราชภัฎอุบลราชธานี ผู้ให้ความอนุเคราะห์ในการทดลอง และที่สำคัญ คือสำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย (สกว.) ที่สนับสนุนงบประมาณการจัดทำโครงงานจนสำเร็จลุล่วงไปได้ด้วยดีและขอขอบพระคุณคุณพ่อคุณแม่และสมาชิกในครอบครัวทุกคนที่ให้การช่วยเหลือในการทำโครงงาน

6. เอกสารอ้างอิง

          [1] การศึกษาฤทธิ์ในการยับยั้งเชื้อจุลินทรีย์ของสารสกัดจากบัวหลวง (2552) โดย ปิยะวดี เจริญวัฒนะ, สุมนา ปานสมุทร, ดำรงค์ คงสวัสดิ์ และอำนวย เพชรประไพ

          [2] สรรพคุณทางยาของบัวหลวง โดย เรือนพีรนันท์                                                  [3] รู้จักกับเชื้ออีโคไล (Escherichia coli) ดร.ภญ.เกษร เทพแปง  นักวิชาการแรงงานชํานาญการ สํานักความปลอดภัยแรงงาน

          [4] Staphylococcus aureus / สตาฟิโลค็อกคัส ออเรียส ผศ.ดร.พิมพ์เพ็ญ พรเฉลิมพงศ์  ศาสตราจารย์เกียรติคุณ ดร.นิธิยา รัตนาปนนท์                                                                                                        [5] ผลของสารสกัดจากมะเขือพวงในการยับยั้งแบคทีเรียก่อโรค Escherichia coli, Staphylococcus aureus และ Salmonella typhimurium (2553)  ศรัญญา พรศักดา, มาระตรี เปลี่ยนศิริชัย, กิตติ ศรีสะอาด, มัณฑนา นครเรียบ ,ประชุมพร เลาห์ประเสริฐ, ทวีรัตน์ วิจิตรสุนทรกุล  และทรงศิลป์.พจน์ชนะชัย

รายงานผลการปฏิบัติงานโครงงานยับยั้งเชื้อ

วันพฤหัสบอดีที่ 30 มกราคม พ.ศ. 2557

                วันนี้คุณครูจริยา จันทวีได้พาไปทำแล็ปยับยั้งเชื้อที่มหาวิยาลัยราชภัฏอุบลราชธานีเวลาประมาณ 14.00 น. พร้อมกับครูอีกท่านหนึ่ง

      โดยจะแบ่งเป็น 2 อย่างคือ
                1. ยั้บยั้งเชื้อโดยสารสกัดจากรากบัว

                2. ยั้บยั้งเชื้อโดยสารสกัดจากดีบัว

      ยับยั้งเชื้อ 2 ชนิด คือ
                1. Escherichia Coli ; E.Coli
                2.Staphylococcus aureus ; S.aureus



ขั้นแรกสกัดสาร
             
               รากบัวสกัดโดยการหั่นแล้วนำไปปั่นให้ละเอียดด้วยเครื่องปั่น จากนั้นคั้นเอาน้ำจากหัวบัว กรองด้วยกระดาษกรองเบอร์ 1

หั่นรากบัว

ปั่นด้วยเครื่องปั่น

ตักใส่ถุงแล้วคั้นเอาน้ำ

กรองด้วยกระดาษกรองเบอร์ 1

               การสกัดสารจากดีบัวทำได้โดยการบดดีบัวด้วยดกร่งให้ละเอียด  เราใช้ดีบัว 6 กรัม จากนั้นตักใส่ถุงเติมนั้น 54 ml. คั้นเอาน้ำ จากนั้นกรองด้วยกระดาษกรองเบอร์ 1

บดดีบัว

หลังจากนั้นก็จะเป็นขั้นตอนของการยับยั้งเชื้อ

แล้วเราก็จะไปดูผลการทดลองวันศุกร์ที่ 31 มกราคม 2557 นี้ค่ะ

เทคนิคการเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อและการทำให้ปราศจากเชื้อ

เทคนิคการเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อและการทำให้ปราศจากเชื้อ

( Culture  medium  and  sterilization Technique) 

วิรุธน์  บัวงาม

               นักวิทยาศาสตร์  วิทยาลัยแพทย์แผนไทยและแพทย์ทางเลือก

มหาวิทยาลัยราชภัฏอุบลราชธานี

บทนำ

   อาหารเลี้ยงเชื้อ (culture  medium) คือ ส่วนประกอบของสารอาหารที่เอื้ออำนวยให้จุลินทรีย์เจริญและแบ่งเซลล์เพิ่มจำนวน  ซึ่งอาหารเลี้ยงเชื้อโดยทั่วไปควรมีคุณสมบัติดังนี้

          1. มีธาตุอาหารและความเข้มข้นที่เหมาะสมกับการเจริญของจุลินทรีย์

          2. มีความเป็นกรดและด่าง ( พีเอช ) เหมาะสมกับการเจริญ

          3. ปราศจากสารพิษที่มีผลต่อการเจริญ

          4. ปราศจากสิ่งมีชีวิตชนิดใด ๆ ในอาหารเลี้ยงเชื้อนั้น

            จุลินทรีย์แต่ละชนิดมีความต้องการธาตุอาหารตลอดจนพีเอชที่แตกต่างกัน ดังนั้นการเลือกใช้อาหารเลี้ยงเชื้อ  จึงต่างกันไปตามความต้องการของจุลินทรีย์และวัตถุประสงค์ของการใช้อาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช้ในงานทางจุลชีววิทยามีหลายลักษณะ  เช่น  อาหารเหลว (broth ) อาหารแข็ง (solid medium) โดยการเติมวุ้น 1.5 – 2.0 % ถ้าอาหารแข็งบรรจุในหลอดทดสอบและทำให้แข็งในลักษณะที่เอียงเป็นแนวลาด เรียก slant agar  แต่ถ้าแข็งในลักษณะหลอดทอสอบตั้งตรง เรียก deep  tube  agar แต่ถ้าบรรจุในจานเพาะเชื้อ (Petri dish) รียก  plate  agar นอกจากนี้ยังมีอาหารลักษณะกึ่งแข็ง(semi – solid) ที่เติมวุ้นเพียง 0.3 – 0.5 % เพื่อใช้ในการทดสอบการเคลื่อนที่ของแบคทีเรีย

อาหารเลี้ยงเชื้อสามารถจำแนกได้เป็น  2  ประเภท

            1.อาหารเลี้ยงเชื้อที่จำแนกตามองค์ประกอบของอาหาร

                   1.1 Complete medium หรือ Non – synthetic medium เป็นอาหารเลี้ยงเชื้อที่ไม่ทราบส่วนประกอบทางเคมีที่แน่นอนทั้งชนิดและปริมาณ  อาหารเลี้ยงเชื้อนี้จะมีสารอินทรีย์มากมายที่ได้จากสารสกัดจากเนื้อเยื่อพืช หรือ สัตว์  เช่น peptone  yeast extract beef  extract หรือ malt extract  เป็นต้น  อาหารเลี้ยงเชื้อชนิดนี้จึงช่วยในการเจริญของจุลินทรีย์ได้หลายชนิด อาหารเลี้ยงเชื้อที่จัดอยู่ในกลุ่มนี้ได้แก่ nutrient broth (NB) nutrient agar (NA) potato  dextrose agar (PDA) หรือ trypticase soy broth เป็นต้น

                   1.2 Chemically defined medium หรือ Synthetic medium เป็นอาหารสังเคราะห์ที่ทราบองค์ประกอบทางเคมีที่แน่นอน ดังนั้นในการเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดนี้แต่ละครั้ง จะได้อาหารที่มีองค์ประกอบเหมือนกันทุกครั้ง  เช่น minimal medium ที่ประกอบด้วย กลูโคส 2.0 กรัม ( NH4)2SO4 1.0 กรัม  K2HPO4  0.7  กรัม  MgSO4 0.5 กรัม  agar  15.0 กรัม และน้ำกลั่น  1000  มิลลิลิตร

            2. อาหารเลี้ยงเชื้อที่จำแนกตามลักษณะการใช้งาน

                   2.1 Enriched   medium   เป็นอาหารลี้ยงเชื้อที่ใช้เพื่อเพิ่มปริมาณเซลล์จุลินทรีย์ที่ต้องการ   ซึ่งมีปริมาณเซลล์อยู่น้อยในตัวอย่างธรรมชาติให้มีจำนวนเพิ่มมากขึ้นในอาหาร โดยการเติมสารอาหารที่เอื้อต่อการเจริญของจุลินทรีย์ชนิดนั้น ๆ   เป็นพิเศษ  ซึ่งจะทำให้การแยกเชื้อชนอดที่ต้องการได้ง่ายขึ้น  ส่วนใหญ่นิยมใช้ในรูปของอาหารเหลว

                   2.2 Selective  medium  เป็นอาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช้เพื่อการคัดเลือกจุลินทรีย์ชนิดที่ต้องการให้เจริญได้เท่านั้น   โดยการเติมสารอาหารที่จุลินทรีย์ต้องการ  สามารถใช้ได้ดี  ในขณะที่จุลินทรีย์อื่นไม่สามารถใช้ได้   หรือการเติมสารยับยั้งการเจริญของจุลินทรีย์ชนิดอื่น ๆ อาหารกลุ่มนี้โดยส่วนใหญ่นิยมใช้ในรูปของอาหารแข็ง

                   2.3  Differential  medium  เป็นอาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช้แยกชนิดของจุลินทรีย์  โดยอาศัยลักษณะที่แตกต่างกันของจุลินทรีย์ เมื่อเจริญบนอาหารที่มีอินดิเคเตอร์ (indicator) เช่น การใช้อาหารวุ้นที่เติมเลือด (blood agar medium) ในการแยกแบคทีเรียที่มีความสามารถในการย่อยสลายเม็ดเลือดแดง (haemolysis) แบคทีเรียที่ย่อยสลายเม็ดเลือดแดงได้จะเกิดบริเวณใส  (clear zone) รอบโคโลนี

            อาหารเลี้ยงเชื้อบางชนิดจัดอยู่ในกลุ่ม selective / differential  medium เช่นMacConkey  agar  ที่มีการเติมเกลือน้ำดี (bile salt) เป็นตัวคัดเลือก (selective agent) โดยเกลือน้ำดีมีผลยับยั้งการเจริญของแบคทีเรียแกรมบวก (Gram – positive  bacteria) แต่ไม่ยับยั้งการเจริญของแบคทีเรียแกรมลบ (Gram - negative  bacteria) เช่นEscherichia coli. Emerobacier sp.,Salmonellasp. และ Proteus sp. อีกทั้งมีน้ำตาลกาแลกโตส และ neutral red ในอาหารเป็นอินดิเคเตอร์บอกความแตกต่าง  ( differential agent) ของจุลินทรีย์แกรมลบที่คัดเลือกได้  ซึ่งแบคทีเรียที่สามารถใช้น้ำตาลกาแลกโตสได้โคโลนีจะเป็นสีแดง เช่น  E.coli  ในขณะที่ Salmonella  sp. ซึ่งขาดความสามารถใช้น้ำตาลกาแลกโตสโคโลนีจะเป็นสีขาว

การกำจัดเชื้อ ( Sterilization )

            วิธีการทำให้อาหารเลี้ยงปราศจากสิ่งมีชีวิตใด ๆ สามารถทำได้โดย

                   1.การใช้ความร้อนชื้น ( moist  heat ) โดยใช้หม้อนึ่งความดันไอ (autoclave ) ในการกำจัดเชื้อในอาหารเลี้ยงเชื้อและภาชนะที่บรรจุ ในห้องปฏิบัติการนิยมใช้ที่อุณหภูมิ 121.5  องศาเซลเซียส  ความดันไอ 15 ปอนด์ต่อตารางนิ้ว เป็นเวลา 15 – 30 นาที  ขึ้นอยู่กับปริมาณอาหารเลี้ยงเชื้อ  ซึ่งไอน้ำร้อนจะแทรกซึมเข้าสู่เซลล์และสปอร์ ทำให้โปรตีน (เอนไซม์) ต่าง ๆ ที่อยู่ภายในเซลล์เสียสภาพทางชีววิทยา

                   2.การใช้ความร้อนแห้ง (dry  heat)  โดยใช้ตู้อบ (hot–air oven) กำจัดเชื้อในเครื่องแก้วเครื่องมือเครื่องใช้ต่างๆ ที่เป็นวัสดุชนิดไม่เสื่อมสภาพได้ง่าย เช่น จานเพาะเชื้อ ปิเปต ขวด  รวมถึงสารเคมีที่เป็นผงบางชนิดที่สามารถทนความร้อนสูงได้ เช่น แป้ง การกำจัดเชื้อโดยวิธีการนี้ทำได้โดยอบที่อุณหภูมิ 180  องศาเซลเซียส  เวลา 1 – 2 ชั่วโมง วิธีการนี้จะทำให้เกิดการดึงน้ำออกจากเซลล์ (dehydrate) และเกิดการ oxidationของสารต่างๆ ภายใน  protoplasm

                   3.การกรอง ( filtration ) โดยใช้เยื่อกรอง หรือแผ่นกรอง (membrane filtration) ที่ทำจาก cellulose  acetate หรือ plastic  polymer ที่มีความหนาเพียง 0.1 มิลลิเมตร  ขนาดของรูเยื่อกรองตั้งแต่ 0.22 – 0.45  ไมโครเมตร  ซึ่งมีขนาดรูเล็กกว่าเซลล์จุลินทรีย์ วิธีการนี้นิยมใช้ในการแยกเชื้อจุลินทรีย์ออกจากอาหารเหลว หรือของเหลวที่สลายตัวได้ง่ายเมื่อถูกความร้อน เช่น ยาปฏิชีวนะ  ซีรั่ม สารละลายน้ำตาลบางชนิด การกำจัดเชื้อด้วยวิธีการนี้จุลินทรีย์ถูกแยกออกจากอาหารเหลว โดยเซลล์จุลินทรีย์จะติดอยู่บนเยื่อกรอง อาหารหรือของเหลวที่ผ่านการกรองแล้วจะปราศจากจุลินทรีย์ ดังนั้นจึงต้องเก็บในภาชนะที่ผ่านการกำจัดเชื้อ

การทดลองที่ 1 การเตรียมและการบรรจุอาหารเลี้ยงเชื้อ

วัตถุประสงค์

          1. เพื่อฝึกการเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ  และกำจัดเชื้อในอาหารเลี้ยงเชื้อนั้นได้อย่างถูกต้อง

          2. สามารถกำจัดเชื้อในเครื่องแก้ว  เครื่องมือ  และอุปกรณ์ต่าง ๆ ที่ใช้ในงานทางจุลชีววิทยาได้อย่างถูกต้อง

อุปกรณ์และสารเคมี

          1.  ส่วนประกอบต่าง ๆ ของอาหาร  nutrient  broth ( NB)  , nutrient  agar(NA)  และ potato  dextrose  agar  (PDA)

          2. เครื่องชั่ง  กระดาษไขรองชั่ง  ( wax paper) ช้อนตักสาร ( spatula)

          3. ภาชนะเตรียมอาหาร  แท่งแก้ว  กระดาษวัดพีเอช  เครื่องมือช่วยกรอกอาหาร

          4. ขวดบรรจุอาหารฝาเกลียว

          5. สำลี กระดาษ ยางรัด ผ้าขาวบาง

          6. หม้อนึ่งความดันไอ (autoclave)

วิธีการทดลอง

          ก. การเตรียม  nutrient  broth

                   1. ชั่งส่วนประกอบต่าง ๆ ตามสูตรอาหารดังต่อไปนี้

                                  Beef  extract                      3      กรัม

                                  Peptone                            5      กรัม

                                  น้ำกลั่น                             1000  มิลลิลิตร

                   2. สารละลายส่วนประกอบต่าง ๆ ในน้ำกลั่น  คนด้วยแท่งแก้วให้ส่วนประกอบของอาหารละลาย  โดยใช้ความร้อนช่วย  แล้วปรับปริมาตรให้ครบตามสูตรด้วยน้ำกลั่น

                   3. วัดความเป็นกรดด่างด้วยกระดาษวัดพีเอช  ถ้าอาหารเป็นกรดหรือด่างมากเกินไปให้ปรับด้วยสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด์เข้มข้น 0.1 นอร์มอล  หรือสารละลายกรดไฮโดรคลอริกเข้มข้น 0.1 นอร์มอล   จนได้พีเอชประมาณ 7.0 

                   4. ในกรณีที่อาหารมีตะกอนหรือเศษผงให้กรองผ่านผ้าขาวบาง

         

          ข. การเตรียม  nutrient  agar 

                   1. ใช้ส่วนประกอบเช่นเดียวกับ NB แล้วเติมวุ้น  15 กรัม

                   2. ต้มพร้อมกับคนด้วยแท่งแก้วจนวุ้นละลายหมด ( อุณหภูมิประมาณ  97– 100 องศาเซลเซียส)

                   3. ปรับปริมาตรให้ครบตามสูตรด้วยน้ำกลั่นและปรับพีเอชให้ได้ประมาณ7.0

          ค. การเตรียม potato dextrose agar 

                   1. สูตรอาหาร  PDA

                                      มันฝรั่ง                               200     กรัม

                                      เดกซ์โทรส                          20      กรัม

                                      วุ้น                                   15      กรัม

                                      น้ำกลั่น                              1000   มิลลิลิตร

                   2.ปอกเปลือกมันฝรั่ง  หั่นเนื้อมันฝรั่งเป็นชิ้นสี่เหลี่ยมลูกบาศก์ขนาดด้านละประมาณ 1 เซนติเมตร  ชั่งให้ได้น้ำหนักตามสูตร  แล้วต้มในน้ำกลั่น  500  มิลลิลิตร  จนเดือดนานประมาณ  10-15 นาที   อย่าทำให้เนื้อมันฝรั่งเละ   กรองเอาแต่น้ำโดยใช้ผ้าขาวบาง

                   3. ชั่งน้ำตาลเดกซ์โทรส  และวุ้นให้ได้น้ำหนักตามสูตร   ละลายในน้ำกลั่น 500  มิลลิลิตร  โดยใช้ความร้อนช่วยจนวุ้นละลายหมด

                   4. ผสมส่วนประกอบจากข้อ 2 และ ข้อ 3 เข้าด้วยกัน  ปรับปริมาตรด้วยน้ำกลั่นจนครบตามสูตร

            ง. การบรรจุอาหาร

                   1.บรรจุอาหารที่เตรียมเสร็จแล้วลงในหม้อกรอกอาหาร  กรอกอาหารใส่ขวดและหลอดทดสอบ  โดยบรรจุ 1 ใน 2 ส่วนของขวด  และ 1 ใน 4 ส่วนของขวด ( กรณีที่เป็นอาหารแข็งให้บรรจุในขณะที่อาหารยังร้อน) ระวังอย่าให้อาหารเปื้อนปากขวดหรือปากหลอด

                   2. ปิดขวดด้วยฝาเกลียวให้สนิทแล้วคลายเกลียวออกครึ่งรอบ  ( ภายหลังการนึ่งฆ่าเชื้อแล้วจึงปิดเกลียวให้แน่น) ปิดหลอดอาหารด้วยการอุดด้วยจุกสำลีที่แน่นพอสมควร  โดยนำสำลีที่ปริมาณเหมาะสมกับขนาดของหลอดทดสอบมาปั้นให้แน่นเป็นแท่งลักษณะทรงกระบอก ทดลองอุดและดึงจุกสำลีหลาย ๆ ครั้ง  จุกสำลีที่ดีจะยังคงรูปอยู่เหมือนเดิม ( ฝึกหัดเทคนิคปฏิบัติจากอาจารย์ผู้สอน)

                   3. หลังจากบรรจุอาหารเรียบร้อยแล้ว  แยกหลอดบรรจุอาหาร NB  NAและ PDA เก็บไว้อย่างละ 2  หลอด  รวบรวมขวดและหลอดอาหารใส่ตะกร้า  ปิดหุ้มด้วยกระดาษหนา ๆ เพื่อป้องกันไอน้ำหยดลงมาทำให้สำลีเปียก  นำไปกำจัดเชื้อด้วยหม้อนึ่งความดันไอ

                   4. ทำความสะอาดภาชนะ  และเครื่องมือต่าง ๆ ที่ใช้ในการเตรียมอาหารให้เรียบร้อย

เอกสารอ้างอิง

จริยา หาญวจนวงศ์ และคณะ. คู่มือปฏิบัติการจุลชีววิทยาทางการแพทย์ สำหรับนักศึกษาแพทย์ชั้นปีที่ 3, ภาควิชาจุลชีววิทยา คณะแพทย์ศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น : 2536

บัญญัติ  สุขศรีงาม. ชีววิทยาเบื้องต้นของเซลล์ .สำนักพิมพ์โอเดียนสโตร์. กรุงเทพฯ :2526

วันเพ็ญ ภูติจันทร์. คู่มือปฏิบัติการพฤกษศาสตร์.อุบลราชธานี:โปรแกรมวิชาชีววิทยา,คณะวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี, สถาบันราชภัฏอุบลราชธานี : 2543

อนันต์  ลือขจร. กล้องจุลทรรศน์และเทคนิคการถ่ายภาพทางชีววิทยา. สำนักพิมพ์โอเดียนสโตร์. กรุงเทพฯ :2536

ที่มา :http://www.l3nr.org/posts/265303