เทคนิคการเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อและการทำให้ปราศจากเชื้อ
( Culture medium and sterilization Technique)
วิรุธน์ บัวงาม
นักวิทยาศาสตร์ วิทยาลัยแพทย์แผนไทยและแพทย์ทางเลือก
มหาวิทยาลัยราชภัฏอุบลราชธานี
บทนำ
อาหารเลี้ยงเชื้อ (culture medium) คือ ส่วนประกอบของสารอาหารที่เอื้ออำนวยให้จุลินทรีย์เจริญและแบ่งเซลล์เพิ่มจำนวน ซึ่งอาหารเลี้ยงเชื้อโดยทั่วไปควรมีคุณสมบัติดังนี้
1. มีธาตุอาหารและความเข้มข้นที่เหมาะสมกับการเจริญของจุลินทรีย์
2. มีความเป็นกรดและด่าง ( พีเอช ) เหมาะสมกับการเจริญ
3. ปราศจากสารพิษที่มีผลต่อการเจริญ
4. ปราศจากสิ่งมีชีวิตชนิดใด ๆ ในอาหารเลี้ยงเชื้อนั้น
จุลินทรีย์แต่ละชนิดมีความต้องการธาตุอาหารตลอดจนพีเอชที่แตกต่างกัน ดังนั้นการเลือกใช้อาหารเลี้ยงเชื้อ จึงต่างกันไปตามความต้องการของจุลินทรีย์และวัตถุประสงค์ของการใช้อาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช้ในงานทางจุลชีววิทยามีหลายลักษณะ เช่น อาหารเหลว (broth ) อาหารแข็ง (solid medium) โดยการเติมวุ้น 1.5 – 2.0 % ถ้าอาหารแข็งบรรจุในหลอดทดสอบและทำให้แข็งในลักษณะที่เอียงเป็นแนวลาด เรียก slant agar แต่ถ้าแข็งในลักษณะหลอดทอสอบตั้งตรง เรียก deep tube agar แต่ถ้าบรรจุในจานเพาะเชื้อ (Petri dish) รียก plate agar นอกจากนี้ยังมีอาหารลักษณะกึ่งแข็ง(semi – solid) ที่เติมวุ้นเพียง 0.3 – 0.5 % เพื่อใช้ในการทดสอบการเคลื่อนที่ของแบคทีเรีย
อาหารเลี้ยงเชื้อสามารถจำแนกได้เป็น 2 ประเภท
1.อาหารเลี้ยงเชื้อที่จำแนกตามองค์ประกอบของอาหาร
1.1 Complete medium หรือ Non – synthetic medium เป็นอาหารเลี้ยงเชื้อที่ไม่ทราบส่วนประกอบทางเคมีที่แน่นอนทั้งชนิดและปริมาณ อาหารเลี้ยงเชื้อนี้จะมีสารอินทรีย์มากมายที่ได้จากสารสกัดจากเนื้อเยื่อพืช หรือ สัตว์ เช่น peptone yeast extract beef extract หรือ malt extract เป็นต้น อาหารเลี้ยงเชื้อชนิดนี้จึงช่วยในการเจริญของจุลินทรีย์ได้หลายชนิด อาหารเลี้ยงเชื้อที่จัดอยู่ในกลุ่มนี้ได้แก่ nutrient broth (NB) nutrient agar (NA) potato dextrose agar (PDA) หรือ trypticase soy broth เป็นต้น
1.2 Chemically defined medium หรือ Synthetic medium เป็นอาหารสังเคราะห์ที่ทราบองค์ประกอบทางเคมีที่แน่นอน ดังนั้นในการเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดนี้แต่ละครั้ง จะได้อาหารที่มีองค์ประกอบเหมือนกันทุกครั้ง เช่น minimal medium ที่ประกอบด้วย กลูโคส 2.0 กรัม ( NH4)2SO4 1.0 กรัม K2HPO4 0.7 กรัม MgSO4 0.5 กรัม agar 15.0 กรัม และน้ำกลั่น 1000 มิลลิลิตร
2. อาหารเลี้ยงเชื้อที่จำแนกตามลักษณะการใช้งาน
2.1 Enriched medium เป็นอาหารลี้ยงเชื้อที่ใช้เพื่อเพิ่มปริมาณเซลล์จุลินทรีย์ที่ต้องการ ซึ่งมีปริมาณเซลล์อยู่น้อยในตัวอย่างธรรมชาติให้มีจำนวนเพิ่มมากขึ้นในอาหาร โดยการเติมสารอาหารที่เอื้อต่อการเจริญของจุลินทรีย์ชนิดนั้น ๆ เป็นพิเศษ ซึ่งจะทำให้การแยกเชื้อชนอดที่ต้องการได้ง่ายขึ้น ส่วนใหญ่นิยมใช้ในรูปของอาหารเหลว
2.2 Selective medium เป็นอาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช้เพื่อการคัดเลือกจุลินทรีย์ชนิดที่ต้องการให้เจริญได้เท่านั้น โดยการเติมสารอาหารที่จุลินทรีย์ต้องการ สามารถใช้ได้ดี ในขณะที่จุลินทรีย์อื่นไม่สามารถใช้ได้ หรือการเติมสารยับยั้งการเจริญของจุลินทรีย์ชนิดอื่น ๆ อาหารกลุ่มนี้โดยส่วนใหญ่นิยมใช้ในรูปของอาหารแข็ง
2.3 Differential medium เป็นอาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช้แยกชนิดของจุลินทรีย์ โดยอาศัยลักษณะที่แตกต่างกันของจุลินทรีย์ เมื่อเจริญบนอาหารที่มีอินดิเคเตอร์ (indicator) เช่น การใช้อาหารวุ้นที่เติมเลือด (blood agar medium) ในการแยกแบคทีเรียที่มีความสามารถในการย่อยสลายเม็ดเลือดแดง (haemolysis) แบคทีเรียที่ย่อยสลายเม็ดเลือดแดงได้จะเกิดบริเวณใส (clear zone) รอบโคโลนี
อาหารเลี้ยงเชื้อบางชนิดจัดอยู่ในกลุ่ม selective / differential medium เช่นMacConkey agar ที่มีการเติมเกลือน้ำดี (bile salt) เป็นตัวคัดเลือก (selective agent) โดยเกลือน้ำดีมีผลยับยั้งการเจริญของแบคทีเรียแกรมบวก (Gram – positive bacteria) แต่ไม่ยับยั้งการเจริญของแบคทีเรียแกรมลบ (Gram - negative bacteria) เช่นEscherichia coli. Emerobacier sp.,Salmonellasp. และ Proteus sp. อีกทั้งมีน้ำตาลกาแลกโตส และ neutral red ในอาหารเป็นอินดิเคเตอร์บอกความแตกต่าง ( differential agent) ของจุลินทรีย์แกรมลบที่คัดเลือกได้ ซึ่งแบคทีเรียที่สามารถใช้น้ำตาลกาแลกโตสได้โคโลนีจะเป็นสีแดง เช่น E.coli ในขณะที่ Salmonella sp. ซึ่งขาดความสามารถใช้น้ำตาลกาแลกโตสโคโลนีจะเป็นสีขาว
การกำจัดเชื้อ ( Sterilization )
วิธีการทำให้อาหารเลี้ยงปราศจากสิ่งมีชีวิตใด ๆ สามารถทำได้โดย
1.การใช้ความร้อนชื้น ( moist heat ) โดยใช้หม้อนึ่งความดันไอ (autoclave ) ในการกำจัดเชื้อในอาหารเลี้ยงเชื้อและภาชนะที่บรรจุ ในห้องปฏิบัติการนิยมใช้ที่อุณหภูมิ 121.5 องศาเซลเซียส ความดันไอ 15 ปอนด์ต่อตารางนิ้ว เป็นเวลา 15 – 30 นาที ขึ้นอยู่กับปริมาณอาหารเลี้ยงเชื้อ ซึ่งไอน้ำร้อนจะแทรกซึมเข้าสู่เซลล์และสปอร์ ทำให้โปรตีน (เอนไซม์) ต่าง ๆ ที่อยู่ภายในเซลล์เสียสภาพทางชีววิทยา
2.การใช้ความร้อนแห้ง (dry heat) โดยใช้ตู้อบ (hot–air oven) กำจัดเชื้อในเครื่องแก้วเครื่องมือเครื่องใช้ต่างๆ ที่เป็นวัสดุชนิดไม่เสื่อมสภาพได้ง่าย เช่น จานเพาะเชื้อ ปิเปต ขวด รวมถึงสารเคมีที่เป็นผงบางชนิดที่สามารถทนความร้อนสูงได้ เช่น แป้ง การกำจัดเชื้อโดยวิธีการนี้ทำได้โดยอบที่อุณหภูมิ 180 องศาเซลเซียส เวลา 1 – 2 ชั่วโมง วิธีการนี้จะทำให้เกิดการดึงน้ำออกจากเซลล์ (dehydrate) และเกิดการ oxidationของสารต่างๆ ภายใน protoplasm
3.การกรอง ( filtration ) โดยใช้เยื่อกรอง หรือแผ่นกรอง (membrane filtration) ที่ทำจาก cellulose acetate หรือ plastic polymer ที่มีความหนาเพียง 0.1 มิลลิเมตร ขนาดของรูเยื่อกรองตั้งแต่ 0.22 – 0.45 ไมโครเมตร ซึ่งมีขนาดรูเล็กกว่าเซลล์จุลินทรีย์ วิธีการนี้นิยมใช้ในการแยกเชื้อจุลินทรีย์ออกจากอาหารเหลว หรือของเหลวที่สลายตัวได้ง่ายเมื่อถูกความร้อน เช่น ยาปฏิชีวนะ ซีรั่ม สารละลายน้ำตาลบางชนิด การกำจัดเชื้อด้วยวิธีการนี้จุลินทรีย์ถูกแยกออกจากอาหารเหลว โดยเซลล์จุลินทรีย์จะติดอยู่บนเยื่อกรอง อาหารหรือของเหลวที่ผ่านการกรองแล้วจะปราศจากจุลินทรีย์ ดังนั้นจึงต้องเก็บในภาชนะที่ผ่านการกำจัดเชื้อ
การทดลองที่ 1 การเตรียมและการบรรจุอาหารเลี้ยงเชื้อ
วัตถุประสงค์
1. เพื่อฝึกการเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ และกำจัดเชื้อในอาหารเลี้ยงเชื้อนั้นได้อย่างถูกต้อง
2. สามารถกำจัดเชื้อในเครื่องแก้ว เครื่องมือ และอุปกรณ์ต่าง ๆ ที่ใช้ในงานทางจุลชีววิทยาได้อย่างถูกต้อง
อุปกรณ์และสารเคมี
1. ส่วนประกอบต่าง ๆ ของอาหาร nutrient broth ( NB) , nutrient agar(NA) และ potato dextrose agar (PDA)
2. เครื่องชั่ง กระดาษไขรองชั่ง ( wax paper) ช้อนตักสาร ( spatula)
3. ภาชนะเตรียมอาหาร แท่งแก้ว กระดาษวัดพีเอช เครื่องมือช่วยกรอกอาหาร
4. ขวดบรรจุอาหารฝาเกลียว
5. สำลี กระดาษ ยางรัด ผ้าขาวบาง
6. หม้อนึ่งความดันไอ (autoclave)
วิธีการทดลอง
ก. การเตรียม nutrient broth
1. ชั่งส่วนประกอบต่าง ๆ ตามสูตรอาหารดังต่อไปนี้
Beef extract 3 กรัม
Peptone 5 กรัม
น้ำกลั่น 1000 มิลลิลิตร
2. สารละลายส่วนประกอบต่าง ๆ ในน้ำกลั่น คนด้วยแท่งแก้วให้ส่วนประกอบของอาหารละลาย โดยใช้ความร้อนช่วย แล้วปรับปริมาตรให้ครบตามสูตรด้วยน้ำกลั่น
3. วัดความเป็นกรดด่างด้วยกระดาษวัดพีเอช ถ้าอาหารเป็นกรดหรือด่างมากเกินไปให้ปรับด้วยสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด์เข้มข้น 0.1 นอร์มอล หรือสารละลายกรดไฮโดรคลอริกเข้มข้น 0.1 นอร์มอล จนได้พีเอชประมาณ 7.0
4. ในกรณีที่อาหารมีตะกอนหรือเศษผงให้กรองผ่านผ้าขาวบาง
ข. การเตรียม nutrient agar
1. ใช้ส่วนประกอบเช่นเดียวกับ NB แล้วเติมวุ้น 15 กรัม
2. ต้มพร้อมกับคนด้วยแท่งแก้วจนวุ้นละลายหมด ( อุณหภูมิประมาณ 97– 100 องศาเซลเซียส)
3. ปรับปริมาตรให้ครบตามสูตรด้วยน้ำกลั่นและปรับพีเอชให้ได้ประมาณ7.0
ค. การเตรียม potato dextrose agar
1. สูตรอาหาร PDA
มันฝรั่ง 200 กรัม
เดกซ์โทรส 20 กรัม
วุ้น 15 กรัม
น้ำกลั่น 1000 มิลลิลิตร
2.ปอกเปลือกมันฝรั่ง หั่นเนื้อมันฝรั่งเป็นชิ้นสี่เหลี่ยมลูกบาศก์ขนาดด้านละประมาณ 1 เซนติเมตร ชั่งให้ได้น้ำหนักตามสูตร แล้วต้มในน้ำกลั่น 500 มิลลิลิตร จนเดือดนานประมาณ 10-15 นาที อย่าทำให้เนื้อมันฝรั่งเละ กรองเอาแต่น้ำโดยใช้ผ้าขาวบาง
3. ชั่งน้ำตาลเดกซ์โทรส และวุ้นให้ได้น้ำหนักตามสูตร ละลายในน้ำกลั่น 500 มิลลิลิตร โดยใช้ความร้อนช่วยจนวุ้นละลายหมด
4. ผสมส่วนประกอบจากข้อ 2 และ ข้อ 3 เข้าด้วยกัน ปรับปริมาตรด้วยน้ำกลั่นจนครบตามสูตร
ง. การบรรจุอาหาร
1.บรรจุอาหารที่เตรียมเสร็จแล้วลงในหม้อกรอกอาหาร กรอกอาหารใส่ขวดและหลอดทดสอบ โดยบรรจุ 1 ใน 2 ส่วนของขวด และ 1 ใน 4 ส่วนของขวด ( กรณีที่เป็นอาหารแข็งให้บรรจุในขณะที่อาหารยังร้อน) ระวังอย่าให้อาหารเปื้อนปากขวดหรือปากหลอด
2. ปิดขวดด้วยฝาเกลียวให้สนิทแล้วคลายเกลียวออกครึ่งรอบ ( ภายหลังการนึ่งฆ่าเชื้อแล้วจึงปิดเกลียวให้แน่น) ปิดหลอดอาหารด้วยการอุดด้วยจุกสำลีที่แน่นพอสมควร โดยนำสำลีที่ปริมาณเหมาะสมกับขนาดของหลอดทดสอบมาปั้นให้แน่นเป็นแท่งลักษณะทรงกระบอก ทดลองอุดและดึงจุกสำลีหลาย ๆ ครั้ง จุกสำลีที่ดีจะยังคงรูปอยู่เหมือนเดิม ( ฝึกหัดเทคนิคปฏิบัติจากอาจารย์ผู้สอน)
3. หลังจากบรรจุอาหารเรียบร้อยแล้ว แยกหลอดบรรจุอาหาร NB NAและ PDA เก็บไว้อย่างละ 2 หลอด รวบรวมขวดและหลอดอาหารใส่ตะกร้า ปิดหุ้มด้วยกระดาษหนา ๆ เพื่อป้องกันไอน้ำหยดลงมาทำให้สำลีเปียก นำไปกำจัดเชื้อด้วยหม้อนึ่งความดันไอ
4. ทำความสะอาดภาชนะ และเครื่องมือต่าง ๆ ที่ใช้ในการเตรียมอาหารให้เรียบร้อย
เอกสารอ้างอิง
จริยา หาญวจนวงศ์ และคณะ. คู่มือปฏิบัติการจุลชีววิทยาทางการแพทย์ สำหรับนักศึกษาแพทย์ชั้นปีที่ 3, ภาควิชาจุลชีววิทยา คณะแพทย์ศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น : 2536
บัญญัติ สุขศรีงาม. ชีววิทยาเบื้องต้นของเซลล์ .สำนักพิมพ์โอเดียนสโตร์. กรุงเทพฯ :2526
วันเพ็ญ ภูติจันทร์. คู่มือปฏิบัติการพฤกษศาสตร์.อุบลราชธานี:โปรแกรมวิชาชีววิทยา,คณะวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี, สถาบันราชภัฏอุบลราชธานี : 2543
อนันต์ ลือขจร. กล้องจุลทรรศน์และเทคนิคการถ่ายภาพทางชีววิทยา. สำนักพิมพ์โอเดียนสโตร์. กรุงเทพฯ :2536
ไม่มีความคิดเห็น:
แสดงความคิดเห็น